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MiP’13-2ª Circularcuenta nueva

Se está organizando la reunión del grupo de Microbiología de Plantas del año 2013.

Más información aquí: MiP’13-1ª Circular

NUEVO:

El Programa y los Ruménes de la próxima reunión del MIP, que tendrá lugar en Tánger (Marruecos) en el mes de febrero, están aquí:

Programa

Libro resumenes MiP ultimos cambios

¡Os esperamos!

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Las plantas han desarrollado varios mecanismos de defensa para combatir a la mayoría de patógenos potenciales. Las moléculas de señalización endógenas: ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA), y etileno (ET); tienen una gran importancia a la hora de activar los sistemas de defensa contra microbios. Por su parte, los patógenos han desarrollado una serie de complejos mecanismos para evadir las respuestas defensivas de las plantas y causar enfermedad en hospedadores susceptibles. Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 produce gran cantidad de factores de virulencia y efectores, que suprimen la respuesta defensiva de la planta y promueven un estado fisiológico de enfermedad. Para entender mejor estos mecanismos nos vamos a encargar de estudiar el papel de la coronatina (COR) como factor de virulencia.

La molécula de COR posee 2 componentes: acido coronofacico (CFA) y ácido coronamico (CMA). COR funciona como una análogo estructural y funcional del JA y componentes señalizadores relacionados (acido metiljasmonico, JA-isoleucina, etc..). Se sabe que COR induce la biosíntesis de JA y su vía de señalización, tanto en tomate como en arabidopsis, pero los papeles de: COR, CMA y CFA; durante la patogénesis en tomate no están bien conocidos como en arabidopsis. Para investigar la importancia de estos en la interaccion entre P. Syringae pv. Tomato DC300 y tomate, se han empleado mutantes que son defectivos en la síntesis de: COR, CFA o CMA; y plantas de tomate que son defectivas en la síntesis de SA mediante silenciamiento de la isocorismato sintasa (ICS).

A nivel de colonizacion se vió que al inocular plantas con los 3 tipos de mutantes, los mutantes para COR eran mucho menos persistentes que los mutantes sencillos CMA y CFA, la incapacdad de los 3 mutantes para mantener una alta densidad de población a los 6 dpi indica que ambos componentes de la COR son importantes para la persistencia del patógeno en tomate. Además mientras la cepa salvaje dio lugar a los sintomas comunes de la enfermedad, caracterizada por manchas necróticas, los 2 mutantes simples (CFA y CMA) mostraron diferentes lesiones, que en el caso del mutante COR eran inexistentes, por lo que los 2 componentes de COR contribuyen diferencialmente al desarrollo de los síntomas en tomate.

Para demostrar el efecto de COR en la ruta del JA se inocularon plantas de tomate con la cepa DC3000 y otras con el mutante COR y se llevaron a cabo RealTime-PCR para medir la expresión de 2 genes envueltos en la ruta del JA. Se vio que en las plantas inoculadas con DC3000 los niveles de ambos genes eran mayores que en el control, y en los mutantes los niveles eran similares, por lo que se confirma que COR estimula la señalizaciónde la ruta del JA.

Las mismas pruebas se llevaron a cabo esta vez para demostrar que COR reprime la síntesis de SA, inoculando sobre plantas de tomate cepas: DC3000 y mutantes COR; y midiendo la expresión de los genes dependientes de SA: PR-1b y PR-2b. Y para saber si esto era debido a la inhibición de SA o de un intermediario, se midieron tamiben los niveles de SA. Las 3 pruebas mostraron como los niveles eran menores en plantas inoculadas con DC3000 que con mutantes COR, por lo que se produce inhibición de la señalización mediada por SA y esto es debido a la reducción de los niveles de SA. Esto se comprobó midiendo los niveles de la ICS viéndose que eran 2 veces mayores en las plantas inoculadas con el mutante que en las inoculadas con la cepa salvaje.

Finalmente para ver cuan afectadas se veian la virulencia y la supervivencia en bacterias sin COR, se inocularon cepas del mutante COR en tomates con la ICS mutada, para eliminar la respuesta defensiva del SA y ver si esto revertia la virulencia en la cepa. El resultado fue que no se revertió el efecto de la mutación en COR, por lo que parece que COR es necesaria para la virulencia y superviviencia de las bacterias.

Terminar diciendo que esta toxina es necesaria para la invasión y enfermedad, ademas son necesarios sus 2 componentes CMA y CFA, ya que ambos son necesarios pero no suficientes para probocar una enfermedad plenamente sintomática; y que una de las formas para conseguir esto es induciendo la síntesis de JA e inhibiendo la de SA.


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Efecto de Thaxtomina A en Arabidopsis thaliana

Thaxtomina A o taxtomina A es una fitotoxina producida por bacterias del genero Streptomyces los cuales raramente son patógenos, aunque pueden producir infecciones tanto en humanos como en plantas, en este último caso S. caviscabies y S. scabie. Thaxtomina A es un dipeptido cíclico siendo el único compuesto de origen natural que se ha sugerido como inhibidor de la síntesis de celulosa, afectando el desarrollo primario de la pared celular mediante principalmente la alteración de la síntesis de novo de los polisacáridos de la pared celular, donde por análisis de fracciones de pared celular radiomarcadas fue posible determinar que la síntesis de pectinas y hemicelulosas (fracción no celulósica) es estimulada después del tratamiento con la fitotoxina mientras que la de celulosa fue fuertemente reducida, lo que implica que la síntesis de celulosa es un objetivo natural de la interacción planta-patógeno, a su vez que las plantas tratadas compensan la disminución en la síntesis de celulosa produciendo otros polisacáridos.

Los resultados obtenidos apoyan la idea general de una amplia remodelación de la pared celular para compensar la reducción de celulosa en plantas tratadas con thaxtomina A.

Además de su rol como inhibidor de la síntesis de celulosa, se ha propuesto su rol como desencadenador de una cascada de señalización mediada por calcio que podría ser
fundamental para la interacción planta-patógeno.

Adicionalmente a los cambios en la composición de polisacáridos, thaxtomina A induce cambios en la expresión de genética en A. thaliana resultando su aplicación tanto en la inducción como en la represión de determinados genes; reprimiendo genes asociados a la biosíntesis primaria de celulosa (CESA, celulosa sintasa) y más fuertemente genes asociados a la síntesis secundaria (pared celular secundaria), adicionalmente genes asociados a síntesis y modificación de pectina se encuentran alterados.

Thaxtomina A afecta directamente a CESA reduciendo su estabilidad y la densidad de esta en la membrana plasmática contribuyendo directamente a la reducción en la biosíntesis de celulosa cristalina.

A su vez el tratamiento con la fitotoxina indujo una fuerte lignificación ectópica exclusivamente en los hipocotiledones, la lignificación concuerda con la alteración de la expresión de genes implicados en la vía de biosíntesis de lignina, el tratamiento con thaxtomina A resulta en una fuerte inducción de genes asociados a lignina, como CCR2 (cinnamyl CoA reductasa) el que se induce durante el ataque de patógenos y estrés, y junto con el alcohol cinnamyl reductasa, participa en la ruta biosintetica de la lignina.

La perturbación en la síntesis de celulosa desencadena la inducción de genes de defensa, induciendo significativamente la expresión de genes asociados a defensa mediada por acido jasmonico así como por acido salicílico pero no así la mediada por etileno, en adición, thaxtomina A induce la deposición de callosa en los cotiledones.

En conclusión thaxtomin A es muy comparable a otros compuestos que modifican la síntesis de celulosa (isoxabeno), conduce a importantes cambios en la composición de la pared celular, la producción de pectinas y hemicelulosas, y resulta en un refuerzo adicional de la pared celular provocado por la lignificación ectópica.

David Durán Wendt Máster en Biotecnología Agroforestal Interacción Molecular Planta Patógeno I

Volker Bischoff1, Sarah Jane Cookson, Shuang Wu and Wolf-Ru¨ diger Scheible1, Thaxtomin A affects CESA-complex density, expression of cell wall genes, cell wall composition, and causes ectopic lignification in Arabidopsis thaliana seedlings, Journal of Experimental Botany, Vol. 60, No. 3, pp. 955–965, 2009

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Universidad Politécnica de Madrid.

ETSIA.

Máster de Biotecnología Agroforestal.

Interacción Molecular Planta-Patógeno.

Pseudomona syringae es una proteobacteria fitopatógena que infecta a un alto número de cultivos. Se caracteriza por presentar un sistema de secreción tipo 3 (SST3), codificado por genes hrp (Hipersensible response and pathogenic); éstos activan los elicitores asociados a respuesta hipersensible (HR) en plantas no hospederas o patogenicidad en hospederos compatibles. Son requeridos por este sistema de secreción para la inyección de los efectores, Hop (Hrp outer protein) o proteínas Avr (avirulencia), siendo esenciales para la patogenicidad de la bacteria. Los genes hrc (genes hrp altamente conservados) son un conjunto de 9 proteínas conservadas de Hrp requeridas para HR, codificando la maquinaria de exportación del SST3 (en animales y en plantas).

Dentro de las proteínas Hrp encontramos 2 grupos diferentes: Hrp1 (Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae (Erwinia amylovora)) y Hrp2 (Rasltonias y Xanthomonas spp).

Este sistema forma canales por donde atraviesan efectores, compuestos bacterianos que son sustratos para el SST3, relacionados con la superación de las barreras de las células del hospedero y el transporte de proteínas por esta vía hasta llegar a las células vegetales. Entre 11 a 17 proteínas Hrp de P.syringae pv. Syringae 61 podrían ser sustratos en el SST3.

Para localizar 11 genes hrp, con capacidad de codificar proteínas para ser sustratos de SST3; se realizaron clones para cada gen (HrpB- Cya, HrpD-Cya, HrpF-Cya, HrpJ-Cya, HrpP-Cya) por Gateway, probados en Nicotiana benthamiana. De los cuales 5 proteínas Hrp fueron capaces de formar sustratos para SST3.

Para probar la secreción de estas 11 proteínas, se usaron células de P. syringae con inducción de Hrp en medio mínimo. Se analizaron por inmunoblot de fluidos del cultivo. Detectándose que solamente HrpJ.

Para determinar el rol de las 11 proteínas Hrp en respuesta HR se hicieron mutaciones no polares. Determinandose que 5 proteínas Hrp son imprescindibles para los elicitores, incluyendo HrpJ y HrpP, que son sustratos para la vía del SST3.

Todos los mutantes fueron capaces de transferir genes Avr a las células de N. benthamiana. Las 5 proteínas identificadas como sustrato del SST3 en P.syringae pv. Syringae 61 son requeridas para la traslocación de genes Avr.

En los mutantes sin factor de traslocación. Solo los mutantes HrpG, HrpJ, HrpT y HrpV secretan AvrPto1 y es bastante menor en mutante HrpJ.

Es el primer reporte de que las proteínas HrpP y HrpF son traslocadas a través del SST3, por tanto podrían tener un papel importante en este sistema respecto del contacto con las células del hospedero. Sugieren que HrpP tiene un rol en el cambio de sustrato. Mientras HrpF es requerido para la secreción, transporte de AvrPto1 y para la respuesta HR. Piensan que HrpF interactúa con las células vegetales durante la infección. Además tiene efecto en la expresión de genes hrp, sugiriendo un rol en el cambio de la especificidad del sustrato.

Conclusiones:

- Los 4 operones codifican componentes estructurales del SST3 de P. syringae, con genes que codifican proteínas que viajan por este canal. Demostraron un rol potencial en la regulación de los genes de expresión del SST3 o el cambio de movimiento (HrpA2, HrpF, HrpJ y HrpP).

- Los mutantes hrpJ y hrpP son incapaces de transferir AvrPto1-Cya, pero tienen habilidad elicitora, generando respuesta HR en N. benthamiana, sugiriendo que algunos efectores aun pueden transportarse, en baja cantidad, en dichos mutantes.

- HrpF, HrpJ y HrpP son más transportadas que otras proteínas Hrp.

- Las 5 proteínas Hrp son posiblemente los principales actores en la adaptación del Hrp1 del SST3, especialmente en la necesidad de efectores especiales para las células vegetales.

Nombre: Viviana Escudero Welsch.

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Rhizobium sp. Cepa NGR234 posee un sistema de secreción de proteínas tipo III que sintetiza un pili esencial para la secreción de proteínas y que permite una simbiosis mucho más eficaz con las leguminosas.

El aislamiento y la purificación parcial de estos pili mostraron que están compuestos por al menos tres proteínas, NopA, NopB, y NopX. Uso de ensayos bioquímicos, nos muestran que estas proteínas interactúan directamente unas con otras.

Muchas bacterias gram negativas emplean sistemas de secreción tipo III
(T3SS) para propagar las proteínas efectoras de la virulencia directamente en células eucariotas en las que transforma sus funciones.

En estos sistemas de secreción, T3SS, dependientes de apéndices extracelulares, la función de dichos apéndices o pili es la de actuar como conducto para que la proteína efectora de la bacteria pueda penetrar en la célula huésped.

Los apéndices de los agentes patógenos de animales, también llamados
aguja complejos, están en su mayoría compuesta de muchas copias de una
proteína de pequeño tamaño. Cuando la aguja entra en contacto con una célula huésped, diferentes proteínas bacterianas sintetizan un poro para favorecer la translocación, estas proteínas se denominan traslocadoras y esto ocurre en la membrana plasmática de la célula objetivo. La formación del poro es esencial para la entrega de las proteínas efectoras.

Los fitopatógenos, como ya he mencionado, producen estructuras similares a estas agujas, llamados pili HRP, y su montaje es dependiente de la respuesta hipersensible y de la patogenicidad del grupo de genes (HRP). El pili HRP también se compone de múltiples copias de una sola proteína pequeña. T3SS de fitopatógenos se cree que también forma poros de translocación en la membrana plasmática de la planta.

HrpF es una proteína translocadora en Xanthomonas campestres pv. Vesicatoria. Se realizó una mutación de dicha proteína y se observó que la secreción de proteínas se podía realizar in vitro pero in vivo la bacteria no podía llevar a cabo la secreción de proteínas a la célula huésped.

Las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno, comúnmente llamadas Rhizobium, son sensibles a una variedad de moléculas señal que regulan la gama
de leguminosas con las que interactúan. Algunas también poseen T3SS funcional, y las proteínas secretadas por estos sistemas (proteínas de nodulación exterior [PON]) son otro factor determinante de su gama de huéspedes. Por ejemplo, en especies de Rhizobium cepa NGR234 por lo menos seis T3SS-PON han
sido identificadas: NopA, NopB, NopC, NopL, NOPP, y NopX. Dependiendo de la leguminosa de acogida, se puede bloquear o no la secreción de Nop por NGR234 y por tanto puede mejorar o bloquearse la interacción simbiótica.

El microscopio electrónico mostró que los métodos que dependen de T3SS con pili de NGR234 están en su mayoría compuestos por NopA y que también contienen NopB y NopX. T3SS dependientes de pili también se han observado en Rhizobium fredii USDA257, donde también está compuesto de varias proteínas.

La caracterización del pili permitió identificar anticuerpos contra dos de estas proteínas como NopB y NopX. Basándose en su abundancia relativa y porque tiene características en su estructura secundaria similares a los de otras subunidades pilus, se concluyó que NopA es el principal componente del pili de NGR234 (ninguno de las principales subunidades de pilus de diferentes especies bacterianas comparten similitud de aminoácidos).

Nop B, dada su similitud con FlgK que es un enlazador de dos proteínas constitutivas de flagelo, el gancho y el filamento, sintetizadas por el sistema de secreción de tipo III, les llevó a pensar que tal vez el papel de NopB podría ser permitir el acoplamiento de proteínas en el caso del pili de la cepa NGR234.

Propusieron tres modelos simples para explicar las posiciones de NopA, NopB, y NopX dentro del pili:

<!–[if mso & !supportInlineShapes & supportFields]> SHAPE \* MERGEFORMAT <![endif]–><!–[if mso & !supportInlineShapes & supportFields]> <![endif]–>

NopX como posible translocador, se ha colocado en el extremo distal del pili, que
penetraría dentro de la membrana plasmática de la planta
de células in vivo. Suponen que en ninguno de los tres modelos hay
un canal directo que permite la secreción de efectoras en
las células vegetales, pero este no es necesariamente el caso, algunos PON
podrían liberarse en el medio extracelular antes de que NopX forme el poro. NopB podría actuar de nexo entre NopA y NopX pudiendo interactuar con ambas.

Con el fin de discriminar entre estos tres modelos, estudiaron las interacciones proteína-proteína entre NopA, NopB, y NopX de NGR234. El tamaño de la cromatografía de exclusión mostró que NopA, NopB, y NopX pertenecen a una gran estructura molecular.

Resultados de algunos de los ensayos demostraron la tendencia de NopA y NopB a asociarse y también puso de manifiesto que estas dos proteínas pueden interactuar directamente sin la necesidad de un tercer intermediario.
Por otro lado, NopX, supuesto translocador, también interactúa con NopA y
NopB.

Si NopX es parte del extremo distal de una estructura contigua
a la formada por NopA y NopB, entonces el orden de la secreción debería ser NopA y NopB, seguido por NopX.

De los pilus modelos presentados en la figura actualmente se apuesta por el modelo que figura como C, ya que encaja mejor con los datos de
interacción proteína-proteína obtenidos.

Queda por determinar exactamente la forma en que interactúan, pero lo más intrigante es el papel de NopB en el pili del T3SS. Potencialmente, esta proteína podría reforzar la estructura de la interacción NopA-NopA o, quizás, su función es
el camuflaje de subunidades de NopA de manera que puedan evitar el reconocimiento
de los receptores de la planta.

Independientemente de esta incertidumbre, el pili de T3SS de la cepa NGR234 es inusual para la interacción planta-bacteria ya que se constituye de varias proteínas.

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Gema Vázquez García

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