El Programa y los Ruménes de la próxima reunión del MIP, que tendrá lugar en Tánger (Marruecos) en el mes de febrero, están aquí:

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¡Os esperamos!

Las plantas han desarrollado varios mecanismos de defensa para combatir a la mayoría de patógenos potenciales. Las moléculas de señalización endógenas: ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA), y etileno (ET); tienen una gran importancia a la hora de activar los sistemas de defensa contra microbios. Por su parte, los patógenos han desarrollado una serie de complejos mecanismos para evadir las respuestas defensivas de las plantas y causar enfermedad en hospedadores susceptibles. Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 produce gran cantidad de factores de virulencia y efectores, que suprimen la respuesta defensiva de la planta y promueven un estado fisiológico de enfermedad. Para entender mejor estos mecanismos nos vamos a encargar de estudiar el papel de la coronatina (COR) como factor de virulencia.

La molécula de COR posee 2 componentes: acido coronofacico (CFA) y ácido coronamico (CMA). COR funciona como una análogo estructural y funcional del JA y componentes señalizadores relacionados (acido metiljasmonico, JA-isoleucina, etc..). Se sabe que COR induce la biosíntesis de JA y su vía de señalización, tanto en tomate como en arabidopsis, pero los papeles de: COR, CMA y CFA; durante la patogénesis en tomate no están bien conocidos como en arabidopsis. Para investigar la importancia de estos en la interaccion entre P. Syringae pv. Tomato DC300 y tomate, se han empleado mutantes que son defectivos en la síntesis de: COR, CFA o CMA; y plantas de tomate que son defectivas en la síntesis de SA mediante silenciamiento de la isocorismato sintasa (ICS).

A nivel de colonizacion se vió que al inocular plantas con los 3 tipos de mutantes, los mutantes para COR eran mucho menos persistentes que los mutantes sencillos CMA y CFA, la incapacdad de los 3 mutantes para mantener una alta densidad de población a los 6 dpi indica que ambos componentes de la COR son importantes para la persistencia del patógeno en tomate. Además mientras la cepa salvaje dio lugar a los sintomas comunes de la enfermedad, caracterizada por manchas necróticas, los 2 mutantes simples (CFA y CMA) mostraron diferentes lesiones, que en el caso del mutante COR eran inexistentes, por lo que los 2 componentes de COR contribuyen diferencialmente al desarrollo de los síntomas en tomate.

Para demostrar el efecto de COR en la ruta del JA se inocularon plantas de tomate con la cepa DC3000 y otras con el mutante COR y se llevaron a cabo RealTime-PCR para medir la expresión de 2 genes envueltos en la ruta del JA. Se vio que en las plantas inoculadas con DC3000 los niveles de ambos genes eran mayores que en el control, y en los mutantes los niveles eran similares, por lo que se confirma que COR estimula la señalizaciónde la ruta del JA.

Las mismas pruebas se llevaron a cabo esta vez para demostrar que COR reprime la síntesis de SA, inoculando sobre plantas de tomate cepas: DC3000 y mutantes COR; y midiendo la expresión de los genes dependientes de SA: PR-1b y PR-2b. Y para saber si esto era debido a la inhibición de SA o de un intermediario, se midieron tamiben los niveles de SA. Las 3 pruebas mostraron como los niveles eran menores en plantas inoculadas con DC3000 que con mutantes COR, por lo que se produce inhibición de la señalización mediada por SA y esto es debido a la reducción de los niveles de SA. Esto se comprobó midiendo los niveles de la ICS viéndose que eran 2 veces mayores en las plantas inoculadas con el mutante que en las inoculadas con la cepa salvaje.

Finalmente para ver cuan afectadas se veian la virulencia y la supervivencia en bacterias sin COR, se inocularon cepas del mutante COR en tomates con la ICS mutada, para eliminar la respuesta defensiva del SA y ver si esto revertia la virulencia en la cepa. El resultado fue que no se revertió el efecto de la mutación en COR, por lo que parece que COR es necesaria para la virulencia y superviviencia de las bacterias.

Terminar diciendo que esta toxina es necesaria para la invasión y enfermedad, ademas son necesarios sus 2 componentes CMA y CFA, ya que ambos son necesarios pero no suficientes para probocar una enfermedad plenamente sintomática; y que una de las formas para conseguir esto es induciendo la síntesis de JA e inhibiendo la de SA.

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Efecto de Thaxtomina A en Arabidopsis thaliana

Thaxtomina A o taxtomina A es una fitotoxina producida por bacterias del genero Streptomyces los cuales raramente son patógenos, aunque pueden producir infecciones tanto en humanos como en plantas, en este último caso S. caviscabies y S. scabie. Thaxtomina A es un dipeptido cíclico siendo el único compuesto de origen natural que se ha sugerido como inhibidor de la síntesis de celulosa, afectando el desarrollo primario de la pared celular mediante principalmente la alteración de la síntesis de novo de los polisacáridos de la pared celular, donde por análisis de fracciones de pared celular radiomarcadas fue posible determinar que la síntesis de pectinas y hemicelulosas (fracción no celulósica) es estimulada después del tratamiento con la fitotoxina mientras que la de celulosa fue fuertemente reducida, lo que implica que la síntesis de celulosa es un objetivo natural de la interacción planta-patógeno, a su vez que las plantas tratadas compensan la disminución en la síntesis de celulosa produciendo otros polisacáridos.

Los resultados obtenidos apoyan la idea general de una amplia remodelación de la pared celular para compensar la reducción de celulosa en plantas tratadas con thaxtomina A.

Además de su rol como inhibidor de la síntesis de celulosa, se ha propuesto su rol como desencadenador de una cascada de señalización mediada por calcio que podría ser
fundamental para la interacción planta-patógeno.

Adicionalmente a los cambios en la composición de polisacáridos, thaxtomina A induce cambios en la expresión de genética en A. thaliana resultando su aplicación tanto en la inducción como en la represión de determinados genes; reprimiendo genes asociados a la biosíntesis primaria de celulosa (CESA, celulosa sintasa) y más fuertemente genes asociados a la síntesis secundaria (pared celular secundaria), adicionalmente genes asociados a síntesis y modificación de pectina se encuentran alterados.

Thaxtomina A afecta directamente a CESA reduciendo su estabilidad y la densidad de esta en la membrana plasmática contribuyendo directamente a la reducción en la biosíntesis de celulosa cristalina.

A su vez el tratamiento con la fitotoxina indujo una fuerte lignificación ectópica exclusivamente en los hipocotiledones, la lignificación concuerda con la alteración de la expresión de genes implicados en la vía de biosíntesis de lignina, el tratamiento con thaxtomina A resulta en una fuerte inducción de genes asociados a lignina, como CCR2 (cinnamyl CoA reductasa) el que se induce durante el ataque de patógenos y estrés, y junto con el alcohol cinnamyl reductasa, participa en la ruta biosintetica de la lignina.

La perturbación en la síntesis de celulosa desencadena la inducción de genes de defensa, induciendo significativamente la expresión de genes asociados a defensa mediada por acido jasmonico así como por acido salicílico pero no así la mediada por etileno, en adición, thaxtomina A induce la deposición de callosa en los cotiledones.

En conclusión thaxtomin A es muy comparable a otros compuestos que modifican la síntesis de celulosa (isoxabeno), conduce a importantes cambios en la composición de la pared celular, la producción de pectinas y hemicelulosas, y resulta en un refuerzo adicional de la pared celular provocado por la lignificación ectópica.

David Durán Wendt Máster en Biotecnología Agroforestal Interacción Molecular Planta Patógeno I

Volker Bischoff1, Sarah Jane Cookson, Shuang Wu and Wolf-Ru¨ diger Scheible1, Thaxtomin A affects CESA-complex density, expression of cell wall genes, cell wall composition, and causes ectopic lignification in Arabidopsis thaliana seedlings, Journal of Experimental Botany, Vol. 60, No. 3, pp. 955–965, 2009

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Universidad Politécnica de Madrid.

ETSIA.

Máster de Biotecnología Agroforestal.

Interacción Molecular Planta-Patógeno.

Pseudomona syringae es una proteobacteria fitopatógena que infecta a un alto número de cultivos. Se caracteriza por presentar un sistema de secreción tipo 3 (SST3), codificado por genes hrp (Hipersensible response and pathogenic); éstos activan los elicitores asociados a respuesta hipersensible (HR) en plantas no hospederas o patogenicidad en hospederos compatibles. Son requeridos por este sistema de secreción para la inyección de los efectores, Hop (Hrp outer protein) o proteínas Avr (avirulencia), siendo esenciales para la patogenicidad de la bacteria. Los genes hrc (genes hrp altamente conservados) son un conjunto de 9 proteínas conservadas de Hrp requeridas para HR, codificando la maquinaria de exportación del SST3 (en animales y en plantas).

Dentro de las proteínas Hrp encontramos 2 grupos diferentes: Hrp1 (Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae (Erwinia amylovora)) y Hrp2 (Rasltonias y Xanthomonas spp).

Este sistema forma canales por donde atraviesan efectores, compuestos bacterianos que son sustratos para el SST3, relacionados con la superación de las barreras de las células del hospedero y el transporte de proteínas por esta vía hasta llegar a las células vegetales. Entre 11 a 17 proteínas Hrp de P.syringae pv. Syringae 61 podrían ser sustratos en el SST3.

Para localizar 11 genes hrp, con capacidad de codificar proteínas para ser sustratos de SST3; se realizaron clones para cada gen (HrpB- Cya, HrpD-Cya, HrpF-Cya, HrpJ-Cya, HrpP-Cya) por Gateway, probados en Nicotiana benthamiana. De los cuales 5 proteínas Hrp fueron capaces de formar sustratos para SST3.

Para probar la secreción de estas 11 proteínas, se usaron células de P. syringae con inducción de Hrp en medio mínimo. Se analizaron por inmunoblot de fluidos del cultivo. Detectándose que solamente HrpJ.

Para determinar el rol de las 11 proteínas Hrp en respuesta HR se hicieron mutaciones no polares. Determinandose que 5 proteínas Hrp son imprescindibles para los elicitores, incluyendo HrpJ y HrpP, que son sustratos para la vía del SST3.

Todos los mutantes fueron capaces de transferir genes Avr a las células de N. benthamiana. Las 5 proteínas identificadas como sustrato del SST3 en P.syringae pv. Syringae 61 son requeridas para la traslocación de genes Avr.

En los mutantes sin factor de traslocación. Solo los mutantes HrpG, HrpJ, HrpT y HrpV secretan AvrPto1 y es bastante menor en mutante HrpJ.

Es el primer reporte de que las proteínas HrpP y HrpF son traslocadas a través del SST3, por tanto podrían tener un papel importante en este sistema respecto del contacto con las células del hospedero. Sugieren que HrpP tiene un rol en el cambio de sustrato. Mientras HrpF es requerido para la secreción, transporte de AvrPto1 y para la respuesta HR. Piensan que HrpF interactúa con las células vegetales durante la infección. Además tiene efecto en la expresión de genes hrp, sugiriendo un rol en el cambio de la especificidad del sustrato.

Conclusiones:

- Los 4 operones codifican componentes estructurales del SST3 de P. syringae, con genes que codifican proteínas que viajan por este canal. Demostraron un rol potencial en la regulación de los genes de expresión del SST3 o el cambio de movimiento (HrpA2, HrpF, HrpJ y HrpP).

- Los mutantes hrpJ y hrpP son incapaces de transferir AvrPto1-Cya, pero tienen habilidad elicitora, generando respuesta HR en N. benthamiana, sugiriendo que algunos efectores aun pueden transportarse, en baja cantidad, en dichos mutantes.

- HrpF, HrpJ y HrpP son más transportadas que otras proteínas Hrp.

- Las 5 proteínas Hrp son posiblemente los principales actores en la adaptación del Hrp1 del SST3, especialmente en la necesidad de efectores especiales para las células vegetales.

Nombre: Viviana Escudero Welsch.

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Rhizobium sp. Cepa NGR234 posee un sistema de secreción de proteínas tipo III que sintetiza un pili esencial para la secreción de proteínas y que permite una simbiosis mucho más eficaz con las leguminosas.

El aislamiento y la purificación parcial de estos pili mostraron que están compuestos por al menos tres proteínas, NopA, NopB, y NopX. Uso de ensayos bioquímicos, nos muestran que estas proteínas interactúan directamente unas con otras.

Muchas bacterias gram negativas emplean sistemas de secreción tipo III
(T3SS) para propagar las proteínas efectoras de la virulencia directamente en células eucariotas en las que transforma sus funciones.

En estos sistemas de secreción, T3SS, dependientes de apéndices extracelulares, la función de dichos apéndices o pili es la de actuar como conducto para que la proteína efectora de la bacteria pueda penetrar en la célula huésped.

Los apéndices de los agentes patógenos de animales, también llamados
aguja complejos, están en su mayoría compuesta de muchas copias de una
proteína de pequeño tamaño. Cuando la aguja entra en contacto con una célula huésped, diferentes proteínas bacterianas sintetizan un poro para favorecer la translocación, estas proteínas se denominan traslocadoras y esto ocurre en la membrana plasmática de la célula objetivo. La formación del poro es esencial para la entrega de las proteínas efectoras.

Los fitopatógenos, como ya he mencionado, producen estructuras similares a estas agujas, llamados pili HRP, y su montaje es dependiente de la respuesta hipersensible y de la patogenicidad del grupo de genes (HRP). El pili HRP también se compone de múltiples copias de una sola proteína pequeña. T3SS de fitopatógenos se cree que también forma poros de translocación en la membrana plasmática de la planta.

HrpF es una proteína translocadora en Xanthomonas campestres pv. Vesicatoria. Se realizó una mutación de dicha proteína y se observó que la secreción de proteínas se podía realizar in vitro pero in vivo la bacteria no podía llevar a cabo la secreción de proteínas a la célula huésped.

Las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno, comúnmente llamadas Rhizobium, son sensibles a una variedad de moléculas señal que regulan la gama
de leguminosas con las que interactúan. Algunas también poseen T3SS funcional, y las proteínas secretadas por estos sistemas (proteínas de nodulación exterior [PON]) son otro factor determinante de su gama de huéspedes. Por ejemplo, en especies de Rhizobium cepa NGR234 por lo menos seis T3SS-PON han
sido identificadas: NopA, NopB, NopC, NopL, NOPP, y NopX. Dependiendo de la leguminosa de acogida, se puede bloquear o no la secreción de Nop por NGR234 y por tanto puede mejorar o bloquearse la interacción simbiótica.

El microscopio electrónico mostró que los métodos que dependen de T3SS con pili de NGR234 están en su mayoría compuestos por NopA y que también contienen NopB y NopX. T3SS dependientes de pili también se han observado en Rhizobium fredii USDA257, donde también está compuesto de varias proteínas.

La caracterización del pili permitió identificar anticuerpos contra dos de estas proteínas como NopB y NopX. Basándose en su abundancia relativa y porque tiene características en su estructura secundaria similares a los de otras subunidades pilus, se concluyó que NopA es el principal componente del pili de NGR234 (ninguno de las principales subunidades de pilus de diferentes especies bacterianas comparten similitud de aminoácidos).

Nop B, dada su similitud con FlgK que es un enlazador de dos proteínas constitutivas de flagelo, el gancho y el filamento, sintetizadas por el sistema de secreción de tipo III, les llevó a pensar que tal vez el papel de NopB podría ser permitir el acoplamiento de proteínas en el caso del pili de la cepa NGR234.

Propusieron tres modelos simples para explicar las posiciones de NopA, NopB, y NopX dentro del pili:

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NopX como posible translocador, se ha colocado en el extremo distal del pili, que
penetraría dentro de la membrana plasmática de la planta
de células in vivo. Suponen que en ninguno de los tres modelos hay
un canal directo que permite la secreción de efectoras en
las células vegetales, pero este no es necesariamente el caso, algunos PON
podrían liberarse en el medio extracelular antes de que NopX forme el poro. NopB podría actuar de nexo entre NopA y NopX pudiendo interactuar con ambas.

Con el fin de discriminar entre estos tres modelos, estudiaron las interacciones proteína-proteína entre NopA, NopB, y NopX de NGR234. El tamaño de la cromatografía de exclusión mostró que NopA, NopB, y NopX pertenecen a una gran estructura molecular.

Resultados de algunos de los ensayos demostraron la tendencia de NopA y NopB a asociarse y también puso de manifiesto que estas dos proteínas pueden interactuar directamente sin la necesidad de un tercer intermediario.
Por otro lado, NopX, supuesto translocador, también interactúa con NopA y
NopB.

Si NopX es parte del extremo distal de una estructura contigua
a la formada por NopA y NopB, entonces el orden de la secreción debería ser NopA y NopB, seguido por NopX.

De los pilus modelos presentados en la figura actualmente se apuesta por el modelo que figura como C, ya que encaja mejor con los datos de
interacción proteína-proteína obtenidos.

Queda por determinar exactamente la forma en que interactúan, pero lo más intrigante es el papel de NopB en el pili del T3SS. Potencialmente, esta proteína podría reforzar la estructura de la interacción NopA-NopA o, quizás, su función es
el camuflaje de subunidades de NopA de manera que puedan evitar el reconocimiento
de los receptores de la planta.

Independientemente de esta incertidumbre, el pili de T3SS de la cepa NGR234 es inusual para la interacción planta-bacteria ya que se constituye de varias proteínas.

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Gema Vázquez García

La “cancrosis de los cítricos” es una bacteriosis causada por Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolli y Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. La primera de ellas es la causante de la cancrosis tipo A, la más grave y extendida en cítricos a nivel mundial. Además, no existe un control efectivo de la enfermedad, por ello, era necesario el estudio de los genes involucrados en patogénesis y adaptación de la bacteria al medio.

Para ver si la inserción de transposones era capaz de alterar la capacidad de esta bacteria de causar enfermedad, a partir de una librería de 10.000 mutantes de X. citri subsp. citri cepa 306, creada por mutagénesis de inserción de transposones, se inocularon 3300 mutantes en plantas huéspedes (plántulas de Citrus limonia) y se analizaron los resultados. Observando los síntomas en cada planta, se identificaron 8 mutantes no patogénicos y 36 mutantes que daban daños reducidos. Con el fin de identificar los genes mutados responsables de esta alteración en la virulencia se secuenció el ADN de los 44 mutantes. Se detectaron 35 ORF mutados.

Estos genes pertenecían a distintos grupos:

- 7 intermediarios del metabolismo

- 3 involucrados en la biosíntesis de pequeñas moléculas

- 4 descritos en otros procesos celulares

- 2 relacionados con los elementos móviles

- 3 involucrados en metabolismo macromolecular

- 2 componentes de la estructura celular

- 4 relacionados con patogénesis, virulencia y adaptación

- 8 ORF hipotéticos

- 2 ORF indefinidos

Además, se analizó el crecimiento de algunos mutantes in vitro e in planta. Se seleccionaron 16 mutantes al azar y se compararon con la cepa silvestre Xcc cepa 306. Los análisis in planta permitieron clasificar los 16 mutantes en 5 grupos en función del número de células por cm². Al crecer estos mismos mutantes en medio de cultivo todos crecían de forma más parecida a la cepa silvestre

Dos de los mutantes clasificados como avirulentos estaban alterados en genes descritos con anterioridad como necesarios para la patogénesis de la bacteria, hrpB4 y hrpXct. Estos genes forman parte del sistema hrp, de respuesta hipersensible y patogénesis, presentes en la mayoría de bacterias fitopatógenas Gram negativas y que son parte de sistemas de secreción tipo III (TTSS). Muchos resultados experimentales sugieren que algunos patógenos inyectan proteínas de virulencia a sus huéspedes mediante este tipo de sistema a través de un pili y que dichas proteínas, también conocidas como efectores, son las encargadas de estimular o reprimir diversas funciones dentro de la célula huésped en beneficio de la infección. Por ello, resultaría lógico que cualquier mutación que impidiese la correcta expresión de estos genes se reflejase directamente, como en este caso sucede, con una pérdida de virulencia del patógeno.

Se puede concluir que estos dos mutantes, 02H02 y 03C01, pierden su virulencia debido a que no son capaces de hacer llegar a la célula huésped factores de virulencia a través del TTSS que son fundamentales para el desarrollo in planta de la bacteria, ya que sin embargo, in vitro estos mutantes se reactivan, siendo su tasa de multiplicación similar a la de la cepa silvestre.

Marcelo L Laia, Leandro M Moreira, Juliana Dezajacomo, Joice B Brigati, Cristiano B Ferreira, Maria IT Ferro, Ana CR Silva, Julio CF Oliveira, Jesus A Ferro. (2009). New genes of Xanthomonas citri subsp. citri involved in pathogenesis and adaptation revealed by a transposon-based mutant library. BMC Microbiology, 9:12 doi:10.1186/1471-2180-9-12.

Inés Cambra Marín

Máster en Biotecnología Agroforestal- IMPPI 2008-2009

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Muchos patógenos gram^- dependen del sistema de secreción tipo III para poder infectar a su hospedador.

Por este sistema se secretan dos tipos de proteínas: las que forman parte del aparato de secreción en sí, y distintos efectores, que se translocan a la célula hospedadora. Las señales que determinan que una proteína se secrete por este sistema se localizan en el N-terminal y no están conservadas a nivel de secuencia de aminoácidos. En muchos casos intervienen chaperonas T3S, que se unen a las proteínas en el citoplasma y las guían hasta el aparato de secreción.

En algunas bacterias patógenas de animales se ha visto que la especificidad de sustrato depende de las proteínas T3S4 (T3S substrate specificity switch proteins). Estas proteínas se encuentran en la membrana interna, y es del dominio C-terminal del que depende la especificidad de sustrato. Estas proteínas no están conservadas muy conservadas en diferentes patógenos, y además sólo se han descrito en animales.

En Xhantomonas campestris pv. vesicatoria el sistema T3S es esencial para que la bacteria crezca y, o bien, produzca síntomas, si la planta es susceptible, o induzca respuesta hipersensible en plantas resistentes.

Los 25 genes que codifican para el T3S están organizados en 8 operones en un cluster cromosómico de 23kb (hrp). La mayoría de los genes hrp son esenciales para que la bacteria sea patógena. La secreción de proteínas está controlada por los productos de los genes hpa (hrp-associated), también incluidos en el cluster. Entre estos está HpaC, que se requiere para la secreción eficiente del traslocon y algunos efectores, y HpaB, una chaperona implicada en la secreción de muchos efectores.

Por estudios de infección con un mutante de deleción hrpB2 se sabe que HrpB2 es necesaria para que la bacteria sea patógena. Esta proteína es esencial para la formación del pilus, y seguramente por eso es una de las primeras que se transloca. La señal de translocación está en el N-terminal, siendo los aminoácidos 10-25 cruciales para la secreción y seguramente para la función. Sin embargo, el modo de actuación de HrpB2 se desconoce.

La secreción de HrpB2 aumenta en ausencia de la proteína de control de exportación HpaC. En estudios de interacción proteína-proteína se ha visto que HrpB2 interacciona con HpaC y con el C-terminal de la proteína de la membrana interna HrcU, que a su vez, también interacciona con HpaC. HrcU, en cambio, no interacciona con otras proteínas secretadas por el T3S, como son HrpE, XopA o XopF1.

El hecho de que HpaC controle la especificidad de sustrato de T3S y que interaccione con el C-terminal de HrcU sugiere que actúa de forma similar a las proteínas T3S4 identificadas en bacterias patógenas de animales.

En resumen, la interacción de HpaC con HrcU promueve el cambio de especificidad de sustrato de HrpB2 a proteínas del translocón y proteínas efectoras.

Christian Lorenz, Steve Schulz, Thomas Wolsch, Ombeline Rossier, Ulla Bonas, Daniela Büttner (2008) HpaC controls substrate specificity of the Xhantomonas type III secretion system. PloS Pathogens, 4(6): e1000094

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Pilar Lasierra

Máster en Biotecnología Agroforestal- IMPPI 2008-2009

Xanthomonas oryzae pv. oryzae es el agente causal de la plaga bacteriana en hojas, una enfermedad grave en arroz. Se ha demostrado que los sistemas de secreción de tipo II (T2S) y tipo III (T3S) son importantes para la virulencia de esta bacteria y para la modulación de la respuesta defensiva que se produce en la planta. Se ha visto que un mutante defectivo en T3S (T3S^-) es capaz de inducir una respuesta defensiva basal en hojas de arroz, medida como depósito de calosa por parte de la planta, además de inducir resistencia frente a posteriores infecciones producidas por la cepa silvestre de X. oryzae pv. oryzae. Mutantes deficientes en ambos sistemas de secreción (T2S^- T3S^-) no son capaces de activar el depósito de calosa ni de inducir resistencia, lo que indica que la respuesta defensiva producida por el mutante T3S^- se debe mayoritariamente a la acción de T2S.

Se sabe que a través de T2S, las bacterias secretan enzimas hidrolíticas (efectores) implicadas en la degradación de la pared de las células vegetales. Mutantes T2S^- de X. oryzae pv. oryzae tienen severamente afectada su virulencia. Se purificaron las proteínas secretadas a través de T2S por la cepa silvestre de X. oryzae pv. oryzae. Una de ellas fue descrita anteriormente como una lipasa-esterasa (LipA). Las otras dos fueron identificadas como una celulasa (o endoglucanasa, ClsA) y una celobiosidasa (o exoglucanasa, CbsA) mediante la obtención y comparación de sus secuencias de aminoácidos con otras especies de Xanthomonas y mediante ensayos de actividad. Se generaron mutantes en estos genes (clsA^-, cbsA^-, lipA^- y lipA^- clsA^-) y se comprobó su virulencia en arroz: el mutante cbsA^- y el doble mutante lipA^- clsA^- tenían drásticamente reducida su virulencia, mientras que los mutantes clsA^- y lipA^- tenían parcialmente afectada su virulencia, lo que sugiere una redundancia funcional.

Los efectores secretados por T2S en X. oryzae pv. oryzae son capaces de inducir respuestas defensivas en arroz (depósito de calosa o generación de una respuesta hipersensible dependiendo de la concentración), excepto cuando se inyectan simultáneamente con la cepa silvestre. Sí se inducen defensas en la planta cuando la coinfección se realiza con T3S^-, lo que sugiere que la supresión de las respuestas defensivas depende de T3S, siendo esta supresión esencial para el avance de la infección. Esto demuestra una clara interacción entre T2S y T3S, modulando las respuestas defensivas en arroz y el avance de la enfermedad. Además, se ha visto que los compuestos producidos por la acción de los efectores sobre la pared celular de las células vegetales (elicitores) son capaces de inducir depósito de calosa o respuesta hipersensible, lo que indica que la respuesta contra los efectores del T2S se debe a los elicitores liberados por su acción sobre la pared celular en lugar de deberse al reconocimiento directo de esos efectores.

Por tanto, la planta de arroz reconocería la presencia de las enzimas hidrolíticas secretadas a través del T2S de X. oryzae pv. oryzae mediante la detección de los productos de degradación de la pared celular generados por su actividad, y pondría en marcha un mecanismo de resistencia para evitar que el patógeno la colonizase, tras lo cual el patógeno respondería secretando compuestos a través de su T3S para vencer las barreras defensivas. Para contrarrestarlo, la planta pondría en marcha un segundo mecanismo de defensa, más específico, desencadenado tras el reconocimiento de los efectores del T3S o del efecto de los mismos.

Sara Sopeña Torres

Interacciones Moleculares Planta-Microorganismo I

Máster en Biotecnología Agroforestal 08-09

Jha G, Rajeshwari R, Sonti RV (2007). Functional interplay between two Xanthomonas oryzae pv. oryzae secretion systems in modulating virulence on rice. Mol. Plant-Microbe Interact. 20:31-40.

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Kay, S; Bonas, U (2009) How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Current Opinion in Microbiology. P.37-43

El presente trabajo se centra en los efectores Tipo III que utiliza el sistema de trasporte T3S (type 3 secretion). Este sistema de secreción está altamente conservado en patógenos y es considerado una “jeringa molecular” que trasporta Xops (Xantomonas outer proteins) sin el procesamiento N-terminal, a través de las dos membranas bacterianas. La mayoría de los efectores Tipo III son traslocados directamente a la célula de la planta, pero se desconoce la función. Lo que sí se ha comprobado es que mutantes de estos sistemas T3S no pueden crecer en la planta y tampoco causan síntomas en plantas susceptibles.

Proteasa SUMO (small ubiquitin-like modifier) XopD

Esta proteína corresponde a X. campestris pv. vesicatoria. Es un efector que promueve el crecimiento bacteriano en tomate. Retrasa la necrosis de los tejidos presumiblemente para poder crecer en la planta. Tiene una estructura modular y cumpliría varias funciones (figura, parte a). El C-terminal es un dominio cystein proteasa (homologo a la ubiquitin-proteasa de levaduras Ulp1, que es también una SUMO).

Esta proteasa SUMO se une covalentemente a proteínas eucariotas y las estabiliza. En las plantas está presente y, de forma natural, regula procesos de estrés, defensa contra patógenos e inducción de floración. Probablemente esta proteína se conjugué a proteínas nucleares de la planta. Además, esta XopD contiene un dominio N-terminal hélice-loop-hélice para unirse a DNA, y dos ERF (ethylene reponse factor) asociados a motivos de represión anfifílicos (EAR). Se ha demostrado que XopD se une a DNA y reprime genes de senescencia y defensa de la planta. Los EAR están implicados en represión génica. También se sabe que los motivos EAR afectan el remodelado de la cromatina (se vio en otros motivos EAR). Estudios de XopD mutantes revelaron que tanto la actividad SUMO proteasa como la actividad de represión de la transcripción, contribuyen en la virulencia.

Familia de efectores YopJ/AvrRxv

También se propuso la función de SUMO-proteasa para esta familia, tanto en patógenos de plantas como de mamíferos. La proteína codificada contiene una triada catalítica putativa (histidina, ácido glutámico y cisteína) que es reconocida por parte de los genes de resistencia.

De todas formas, la función de esta familia es controvertida porque se ha reportado actividad acetil transferasa (acetilan residuos serina y treonina lo cuál previene la fosforilación y la consecuente activación de la respuesta inmune. Esto se vio en patógenos de mamíferos).

Familia AvrBs3: manipuladores de la trascripción

La actividad de varias proteínas efectoras del Tipo III finalmente resulta en un cambio de expresión de los genes de las plantas. Se demostró que AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria pertenece a una familia, también conocida como efectores TAL (trascripción activator-like), ya que actúan como factores de transcripción y directamente inducen la expresión de genes de la planta. El AvrBs3 también tiene secuencias que no están relacionadas con la proteína efectora vinculadas a mimetizar factores de transcripción eucariotas (ver figura, parte b). La familia AvrBs3 está solo Xantomonas spp. y comprende los factores de virulencia más importante.

Por la estructura de AvrB3, se supone que sus efectores son promotores de genes de la planta huésped. Tiene una zona central repetida que es típica de sitios de unión a DNA. Además, la proteína tiene una señal de localización nuclear, para la importación al núcleo, y un dominio de activación acídico en el C-terminal, para mediar la activación de genes (ver figura, parte b y c).

Con microarrays se han identificado varios genes del tipo AvrB3, y en la planta, usando AFLP, se identificaron posibles targets de estos genes. Lo que se vio es que son genes que codifican, por ejemplo, para factores de transcripción que regulan la respuesta hipersensible (HR). Las plantas han desarrollado genes de resistencia R. La activación de genes promovida por efectores TAL induce los genes R y una subsecuente muerte celular.

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Mariana Emiliozzi

Interacciones Moleculares Planta Microorganismo I

Máster en Biotecnología Agroforestal

El sistema de secreción tipo VI (T6SS) está presente en bacterias Gram-negativas tanto patógenas como simbióticas que interactúan con eucariotas.

Los productos génicos del T6SS que no son secretados se cree que son componentes estructurales del aparato de secreción, o contribuyen al proceso de translocación, suministrando la energía necesaria para impulsar a los sustratos a través del canal de secreción. La mayoría de los componentes conocidos hasta la fecha no son secretados pero son necesarios para la secreción de: VgrG (valine–glycine repeat protein G) y Hcp (Haemolysin coregulated protein), proteína característica de T6SS funcionales, la proteína Hcp es la responsable de la formación del anillo hexamerico característico de T6SS el cual fácilmente polimeriza y forma el conducto del sistema de secreción.

Este transportador se caracteriza por secretar factores solubles (tres proteínas efectoras candidatas recientemente determinadas, RbsB, EvpP y TssM), donde la primera prueba surgió del estudio de Rhizobium leguminosarum, que transporta pequeñas proteínas unidas a ribosa (RbsB) aunque la importancia biológica de RbsB para T6SS todavía no se ha determinado. EvpP puede interaccionar con Hcp al viajar a través del conducto que esta proteína forma, similar a un efector soluble del T4SS, el cual se une al pili T4SS. Adicionalmente EvpP puede ser expulsado al crecer el conducto formado por Hcp junto con la “punta”VgrG. TssM, retira la señal de ubiquitinacion de las proteínas que son objeto de degradación, lo cual es intrigante ya que S6TT secretaria efectores que interfieren con la vía de degradación mediada por ubiquitina.

Los componentes estructurales de T6SS comparten características con el complejo de inyección (aguja) del bacteriófago T4, específicamente las proteínas VgrG, que se relacionan con el dispositivo de perforación del bacteriófago, empleado para punzar e insertar el ADN del fago. Pero a diferencia del fago este complejo está formado por un solo polipeptido (VgrG)₃ (formando un complejo multimerico) en vez del complejo de dos proteínas trimericas del fago.

De acuerdo a la homología con el complejo de T4 y al hecho de que los componentes del T6SS son necesarios para detectar VgrGs en el sobrenadante de cultivos, se ha propuesto que VgrGs son parte de la superficie expuesta del T6SS. La mayoría de los genes de VgrG no forman parte del cluster de T6SS, se encuentran dispersos en el genoma bacterial, por lo que es probable que lleve a cabo alguna función necesaria para algunos, pero no todos los agentes patógenos con T6SS.

Debido a que la estructura macromolecular de T6SS todavía no se ha resuelto, no se sabe cómo T6SS se ensambla o como secreta a los efectores, aunque la evidencia experimental apoya un modelo de T6SS que imita el mecanismo de“entrega”(secreción) del bacteriófago T4, en el cual Hcp y VgrG forman un pilus que se muestra en la superficie bacterial, donde VgrG posee una doble función; perforando la membrana delante del tubo formado por Hcp y como una molécula efectora (VgrGs), si este modelo es correcto, T6SS utiliza partes de su maquinaria para interferir con los procesos en la célula huésped.

El modelo propuesto requiere que el complejo T6SS en la membrana bacteriana interna exporte Hcp y VgrGs al periplasma, siendo esta una localización temporal. En el periplasma VgrG forma un complejo trimerico similar al complejo de perforación del T4 y debajo de este complejo se va formando en tubo en base a los anillos Hcp, este tubo creciente atraviesa un poro en la membrana externa o tal vez utiliza a VgrG para atravesar la membrana y permitir la ampliación hacia el exterior del tubo en el espacio extracelular.

Cuando la bacteria entra en contacto con un hospedero, la punta formada por el trimero VgrG es empujada a través de la membrana y el dominio efector de esta interactúa con su diana respectiva en el hospedero, una opción es que el trímero sea escindido e interactué con dianas distantes, permitiendo la traslocacion de las proteínas efectoras.

MGM

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