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La “cancrosis de los cítricos” es una bacteriosis causada por Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolli y Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. La primera de ellas es la causante de la cancrosis tipo A, la más grave y extendida en cítricos a nivel mundial. Además, no existe un control efectivo de la enfermedad, por ello, era necesario el estudio de los genes involucrados en patogénesis y adaptación de la bacteria al medio.

Para ver si la inserción de transposones era capaz de alterar la capacidad de esta bacteria de causar enfermedad, a partir de una librería de 10.000 mutantes de X. citri subsp. citri cepa 306, creada por mutagénesis de inserción de transposones, se inocularon 3300 mutantes en plantas huéspedes (plántulas de Citrus limonia) y se analizaron los resultados. Observando los síntomas en cada planta, se identificaron 8 mutantes no patogénicos y 36 mutantes que daban daños reducidos. Con el fin de identificar los genes mutados responsables de esta alteración en la virulencia se secuenció el ADN de los 44 mutantes. Se detectaron 35 ORF mutados.

Estos genes pertenecían a distintos grupos:

7 intermediarios del metabolismo

3 involucrados en la biosíntesis de pequeñas moléculas

4 descritos en otros procesos celulares

2 relacionados con los elementos móviles

3 involucrados en metabolismo macromolecular

2 componentes de la estructura celular

4 relacionados con patogénesis, virulencia y adaptación

8 ORF hipotéticos

2 ORF indefinidos

Además, se analizó el crecimiento de algunos mutantes in vitro e in planta. Se seleccionaron 16 mutantes al azar y se compararon con la cepa silvestre Xcc cepa 306. Los análisis in planta permitieron clasificar los 16 mutantes en 5 grupos en función del número de células por cm2. Al crecer estos mismos mutantes en medio de cultivo todos crecían de forma más parecida a la cepa silvestre

Dos de los mutantes clasificados como avirulentos estaban alterados en genes descritos con anterioridad como necesarios para la patogénesis de la bacteria, hrpB4 y hrpXct. Estos genes forman parte del sistema hrp, de respuesta hipersensible y patogénesis, presentes en la mayoría de bacterias fitopatógenas Gram negativas y que son parte de sistemas de secreción tipo III (TTSS). Muchos resultados experimentales sugieren que algunos patógenos inyectan proteínas de virulencia a sus huéspedes mediante este tipo de sistema a través de un pili y que dichas proteínas, también conocidas como efectores, son las encargadas de estimular o reprimir diversas funciones dentro de la célula huésped en beneficio de la infección. Por ello, resultaría lógico que cualquier mutación que impidiese la correcta expresión de estos genes se reflejase directamente, como en este caso sucede, con una pérdida de virulencia del patógeno.

Se puede concluir que estos dos mutantes, 02H02 y 03C01, pierden su virulencia debido a que no son capaces de hacer llegar a la célula huésped factores de virulencia a través del TTSS que son fundamentales para el desarrollo in planta de la bacteria, ya que sin embargo, in vitro estos mutantes se reactivan, siendo su tasa de multiplicación similar a la de la cepa silvestre.

Marcelo L Laia, Leandro M Moreira, Juliana Dezajacomo, Joice B Brigati, Cristiano B Ferreira, Maria IT Ferro, Ana CR Silva, Julio CF Oliveira, Jesus A Ferro. (2009). New genes of Xanthomonas citri subsp. citri involved in pathogenesis and adaptation revealed by a transposon-based mutant library. BMC Microbiology, 9:12 doi:10.1186/1471-2180-9-12.

Inés Cambra Marín

Máster en Biotecnología Agroforestal- IMPPI 2008-2009

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Muchos patógenos gram dependen del sistema de secreción tipo III para poder infectar a su hospedador.

Por este sistema se secretan dos tipos de proteínas: las que forman parte del aparato de secreción en sí, y distintos efectores, que se translocan a la célula hospedadora. Las señales que determinan que una proteína se secrete por este sistema se localizan en el N-terminal y no están conservadas a nivel de secuencia de aminoácidos. En muchos casos intervienen chaperonas T3S, que se unen a las proteínas en el citoplasma y las guían hasta el aparato de secreción.

En algunas bacterias patógenas de animales se ha visto que la especificidad de sustrato depende de las proteínas T3S4 (T3S substrate specificity switch proteins). Estas proteínas se encuentran en la membrana interna, y es del dominio C-terminal del que depende la especificidad de sustrato. Estas proteínas no están conservadas muy conservadas en diferentes patógenos, y además sólo se han descrito en animales.

En Xhantomonas campestris pv. vesicatoria el sistema T3S es esencial para que la bacteria crezca y, o bien, produzca síntomas, si la planta es susceptible, o induzca respuesta hipersensible en plantas resistentes.

Los 25 genes que codifican para el T3S están organizados en 8 operones en un cluster cromosómico de 23kb (hrp). La mayoría de los genes hrp son esenciales para que la bacteria sea patógena. La secreción de proteínas está controlada por los productos de los genes hpa (hrp-associated), también incluidos en el cluster. Entre estos está HpaC, que se requiere para la secreción eficiente del traslocon y algunos efectores, y HpaB, una chaperona implicada en la secreción de muchos efectores.

Por estudios de infección con un mutante de deleción hrpB2 se sabe que HrpB2 es necesaria para que la bacteria sea patógena. Esta proteína es esencial para la formación del pilus, y seguramente por eso es una de las primeras que se transloca. La señal de translocación está en el N-terminal, siendo los aminoácidos 10-25 cruciales para la secreción y seguramente para la función. Sin embargo, el modo de actuación de HrpB2 se desconoce.

La secreción de HrpB2 aumenta en ausencia de la proteína de control de exportación HpaC. En estudios de interacción proteína-proteína se ha visto que HrpB2 interacciona con HpaC y con el C-terminal de la proteína de la membrana interna HrcU, que a su vez, también interacciona con HpaC. HrcU, en cambio, no interacciona con otras proteínas secretadas por el T3S, como son HrpE, XopA o XopF1.

El hecho de que HpaC controle la especificidad de sustrato de T3S y que interaccione con el C-terminal de HrcU sugiere que actúa de forma similar a las proteínas T3S4 identificadas en bacterias patógenas de animales.

En resumen, la interacción de HpaC con HrcU promueve el cambio de especificidad de sustrato de HrpB2 a proteínas del translocón y proteínas efectoras.

Christian Lorenz, Steve Schulz, Thomas Wolsch, Ombeline Rossier, Ulla Bonas, Daniela Büttner (2008) HpaC controls substrate specificity of the Xhantomonas type III secretion system. PloS Pathogens, 4(6): e1000094

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Pilar Lasierra

Máster en Biotecnología Agroforestal- IMPPI 2008-2009

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Xanthomonas oryzae pv. oryzae es el agente causal de la plaga bacteriana en hojas, una enfermedad grave en arroz. Se ha demostrado que los sistemas de secreción de tipo II (T2S) y tipo III (T3S) son importantes para la virulencia de esta bacteria y para la modulación de la respuesta defensiva que se produce en la planta. Se ha visto que un mutante defectivo en T3S (T3S) es capaz de inducir una respuesta defensiva basal en hojas de arroz, medida como depósito de calosa por parte de la planta, además de inducir resistencia frente a posteriores infecciones producidas por la cepa silvestre de X. oryzae pv. oryzae. Mutantes deficientes en ambos sistemas de secreción (T2S T3S) no son capaces de activar el depósito de calosa ni de inducir resistencia, lo que indica que la respuesta defensiva producida por el mutante T3S se debe mayoritariamente a la acción de T2S.

Se sabe que a través de T2S, las bacterias secretan enzimas hidrolíticas (efectores) implicadas en la degradación de la pared de las células vegetales. Mutantes T2S de X. oryzae pv. oryzae tienen severamente afectada su virulencia. Se purificaron las proteínas secretadas a través de T2S por la cepa silvestre de X. oryzae pv. oryzae. Una de ellas fue descrita anteriormente como una lipasa-esterasa (LipA). Las otras dos fueron identificadas como una celulasa (o endoglucanasa, ClsA) y una celobiosidasa (o exoglucanasa, CbsA) mediante la obtención y comparación de sus secuencias de aminoácidos con otras especies de Xanthomonas y mediante ensayos de actividad. Se generaron mutantes en estos genes (clsA, cbsA, lipA y lipA clsA) y se comprobó su virulencia en arroz: el mutante cbsA y el doble mutante lipA clsA tenían drásticamente reducida su virulencia, mientras que los mutantes clsA y lipA tenían parcialmente afectada su virulencia, lo que sugiere una redundancia funcional.

Los efectores secretados por T2S en X. oryzae pv. oryzae son capaces de inducir respuestas defensivas en arroz (depósito de calosa o generación de una respuesta hipersensible dependiendo de la concentración), excepto cuando se inyectan simultáneamente con la cepa silvestre. Sí se inducen defensas en la planta cuando la coinfección se realiza con T3S, lo que sugiere que la supresión de las respuestas defensivas depende de T3S, siendo esta supresión esencial para el avance de la infección. Esto demuestra una clara interacción entre T2S y T3S, modulando las respuestas defensivas en arroz y el avance de la enfermedad. Además, se ha visto que los compuestos producidos por la acción de los efectores sobre la pared celular de las células vegetales (elicitores) son capaces de inducir depósito de calosa o respuesta hipersensible, lo que indica que la respuesta contra los efectores del T2S se debe a los elicitores liberados por su acción sobre la pared celular en lugar de deberse al reconocimiento directo de esos efectores.

Por tanto, la planta de arroz reconocería la presencia de las enzimas hidrolíticas secretadas a través del T2S de X. oryzae pv. oryzae mediante la detección de los productos de degradación de la pared celular generados por su actividad, y pondría en marcha un mecanismo de resistencia para evitar que el patógeno la colonizase, tras lo cual el patógeno respondería secretando compuestos a través de su T3S para vencer las barreras defensivas. Para contrarrestarlo, la planta pondría en marcha un segundo mecanismo de defensa, más específico, desencadenado tras el reconocimiento de los efectores del T3S o del efecto de los mismos.

Sara Sopeña Torres

Interacciones Moleculares Planta-Microorganismo I

Máster en Biotecnología Agroforestal 08-09

Jha G, Rajeshwari R, Sonti RV (2007). Functional interplay between two Xanthomonas oryzae pv. oryzae secretion systems in modulating virulence on rice. Mol. Plant-Microbe Interact. 20:31-40.

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Kay, S; Bonas, U (2009) How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Current Opinion in Microbiology. P.37-43

El presente trabajo se centra en los efectores Tipo III que utiliza el sistema de trasporte T3S (type 3 secretion). Este sistema de secreción está altamente conservado en patógenos y es considerado una “jeringa molecular” que trasporta Xops (Xantomonas outer proteins) sin el procesamiento N-terminal, a través de las dos membranas bacterianas. La mayoría de los efectores Tipo III son traslocados directamente a la célula de la planta, pero se desconoce la función. Lo que sí se ha comprobado es que mutantes de estos sistemas T3S no pueden crecer en la planta y tampoco causan síntomas en plantas susceptibles.

Proteasa SUMO (small ubiquitin-like modifier) XopD

Esta proteína corresponde a X. campestris pv. vesicatoria. Es un efector que promueve el crecimiento bacteriano en tomate. Retrasa la necrosis de los tejidos presumiblemente para poder crecer en la planta. Tiene una estructura modular y cumpliría varias funciones (figura, parte a). El C-terminal es un dominio cystein proteasa (homologo a la ubiquitin-proteasa de levaduras Ulp1, que es también una SUMO).

Esta proteasa SUMO se une covalentemente a proteínas eucariotas y las estabiliza. En las plantas está presente y, de forma natural, regula procesos de estrés, defensa contra patógenos e inducción de floración. Probablemente esta proteína se conjugué a proteínas nucleares de la planta. Además, esta XopD contiene un dominio N-terminal hélice-loop-hélice para unirse a DNA, y dos ERF (ethylene reponse factor) asociados a motivos de represión anfifílicos (EAR). Se ha demostrado que XopD se une a DNA y reprime genes de senescencia y defensa de la planta. Los EAR están implicados en represión génica. También se sabe que los motivos EAR afectan el remodelado de la cromatina (se vio en otros motivos EAR). Estudios de XopD mutantes revelaron que tanto la actividad SUMO proteasa como la actividad de represión de la transcripción, contribuyen en la virulencia.

Familia de efectores YopJ/AvrRxv

También se propuso la función de SUMO-proteasa para esta familia, tanto en patógenos de plantas como de mamíferos. La proteína codificada contiene una triada catalítica putativa (histidina, ácido glutámico y cisteína) que es reconocida por parte de los genes de resistencia.

De todas formas, la función de esta familia es controvertida porque se ha reportado actividad acetil transferasa (acetilan residuos serina y treonina lo cuál previene la fosforilación y la consecuente activación de la respuesta inmune. Esto se vio en patógenos de mamíferos).

Familia AvrBs3: manipuladores de la trascripción

La actividad de varias proteínas efectoras del Tipo III finalmente resulta en un cambio de expresión de los genes de las plantas. Se demostró que AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria pertenece a una familia, también conocida como efectores TAL (trascripción activator-like), ya que actúan como factores de transcripción y directamente inducen la expresión de genes de la planta. El AvrBs3 también tiene secuencias que no están relacionadas con la proteína efectora vinculadas a mimetizar factores de transcripción eucariotas (ver figura, parte b). La familia AvrBs3 está solo Xantomonas spp. y comprende los factores de virulencia más importante.

Por la estructura de AvrB3, se supone que sus efectores son promotores de genes de la planta huésped. Tiene una zona central repetida que es típica de sitios de unión a DNA. Además, la proteína tiene una señal de localización nuclear, para la importación al núcleo, y un dominio de activación acídico en el C-terminal, para mediar la activación de genes (ver figura, parte b y c).

Con microarrays se han identificado varios genes del tipo AvrB3, y en la planta, usando AFLP, se identificaron posibles targets de estos genes. Lo que se vio es que son genes que codifican, por ejemplo, para factores de transcripción que regulan la respuesta hipersensible (HR). Las plantas han desarrollado genes de resistencia R. La activación de genes promovida por efectores TAL induce los genes R y una subsecuente muerte celular.

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Mariana Emiliozzi

Interacciones Moleculares Planta Microorganismo I

Máster en Biotecnología Agroforestal

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El sistema de secreción tipo VI (T6SS) está presente en bacterias Gram-negativas tanto patógenas como simbióticas que interactúan con eucariotas.

Los productos génicos del T6SS que no son secretados se cree que son componentes estructurales del aparato de secreción, o contribuyen al proceso de translocación, suministrando la energía necesaria para impulsar a los sustratos a través del canal de secreción. La mayoría de los componentes conocidos hasta la fecha no son secretados pero son necesarios para la secreción de: VgrG (valine–glycine repeat protein G) y Hcp (Haemolysin coregulated protein), proteína característica de T6SS funcionales, la proteína Hcp es la responsable de la formación del anillo hexamerico característico de T6SS el cual fácilmente polimeriza y forma el conducto del sistema de secreción.

Este transportador se caracteriza por secretar factores solubles (tres proteínas efectoras candidatas recientemente determinadas, RbsB, EvpP y TssM), donde la primera prueba surgió del estudio de Rhizobium leguminosarum, que transporta pequeñas proteínas unidas a ribosa (RbsB) aunque la importancia biológica de RbsB para T6SS todavía no se ha determinado. EvpP puede interaccionar con Hcp al viajar a través del conducto que esta proteína forma, similar a un efector soluble del T4SS, el cual se une al pili T4SS. Adicionalmente EvpP puede ser expulsado al crecer el conducto formado por Hcp junto con la “punta”VgrG. TssM, retira la señal de ubiquitinacion de las proteínas que son objeto de degradación, lo cual es intrigante ya que S6TT secretaria efectores que interfieren con la vía de degradación mediada por ubiquitina.

Los componentes estructurales de T6SS comparten características con el complejo de inyección (aguja) del bacteriófago T4, específicamente las proteínas VgrG, que se relacionan con el dispositivo de perforación del bacteriófago, empleado para punzar e insertar el ADN del fago. Pero a diferencia del fago este complejo está formado por un solo polipeptido (VgrG)3 (formando un complejo multimerico) en vez del complejo de dos proteínas trimericas del fago.

De acuerdo a la homología con el complejo de T4 y al hecho de que los componentes del T6SS son necesarios para detectar VgrGs en el sobrenadante de cultivos, se ha propuesto que VgrGs son parte de la superficie expuesta del T6SS. La mayoría de los genes de VgrG no forman parte del cluster de T6SS, se encuentran dispersos en el genoma bacterial, por lo que es probable que lleve a cabo alguna función necesaria para algunos, pero no todos los agentes patógenos con T6SS.

Debido a que la estructura macromolecular de T6SS todavía no se ha resuelto, no se sabe cómo T6SS se ensambla o como secreta a los efectores, aunque la evidencia experimental apoya un modelo de T6SS que imita el mecanismo de“entrega”(secreción) del bacteriófago T4, en el cual Hcp y VgrG forman un pilus que se muestra en la superficie bacterial, donde VgrG posee una doble función; perforando la membrana delante del tubo formado por Hcp y como una molécula efectora (VgrGs), si este modelo es correcto, T6SS utiliza partes de su maquinaria para interferir con los procesos en la célula huésped.


El modelo propuesto requiere que el complejo T6SS en la membrana bacteriana interna exporte Hcp y VgrGs al periplasma, siendo esta una localización temporal. En el periplasma VgrG forma un complejo trimerico similar al complejo de perforación del T4 y debajo de este complejo se va formando en tubo en base a los anillos Hcp, este tubo creciente atraviesa un poro en la membrana externa o tal vez utiliza a VgrG para atravesar la membrana y permitir la ampliación hacia el exterior del tubo en el espacio extracelular.

Cuando la bacteria entra en contacto con un hospedero, la punta formada por el trimero VgrG es empujada a través de la membrana y el dominio efector de esta interactúa con su diana respectiva en el hospedero, una opción es que el trímero sea escindido e interactué con dianas distantes, permitiendo la traslocacion de las proteínas efectoras.

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Universidad Politécnica de Madrid.

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Máster de Biotecnología Agroforestal.

Interacción Molecular Planta-Patógeno.

EL SISTEMA DE SECRECIÓN TIPO III (TTSS) Y ALGUNOS DETERMINANTES DE VIRULENCIA EN R. solanacearum

El sistema de secreción tipo III (TTSS, siglas en ingles) en bacterias fitopatógenas permite secretar proteínas efectoras dentro de las células eucariotas del huésped siendo esencial para el desarrollo de la enfermedad. La transcripción de este sistema de secreción tipo III y los sustratos de los efectores es fuertemente controlada por la activación de reguladores.

Este artículo parte de la base de que la cascada reguladora que controla la programación genética del sistema de secreción tipo III, es poco conocido y no se ha catalogado exhaustivamente los genes afectados por la regulación local corriente arriba, especialmente en bacterias fitopatogenas. En este articulo se deduce que la activación de la cascada del sistema de secreción tipo III es desencadenada por factores reguladores denominados HrpG (por sus siglas en ingles Hypersensitive response and pathogenicity) e integrada por otros factores de virulencia como hormonas y enzimas degradadotas de pared celular.

Se comprueba que HrpG coordina la expresión de dos rutas, una dependiente y otra a HrpB (otro gen regulador), la ruta dependiente regula la expresión de genes estructurales de al sistema de secreción tipo III y de proteínas efectoras. La otra ruta independiente de HrpB regula genes involucrados con funciones de colonización y adaptación al huésped (genes que codifican para la biosíntesis de EPS, degradación de célula). Estos reguladores estarían involucrados en la transición y adaptación de la vida como saprofito en el suelo a una vida como parasito en la planta y la biogénesis del sistema de secreción tipo III.

Se demostró que las fitohormonas etileno y auxinas producidas por R. solanacerum, son controlado por el gen hrp, cuya actividad es inducida en presencia de célula de plantas, sugiriendo que estas hormonas juegan un papel clave en el inicio de la infección complementando la acción del TTSS. Otros factores determinantes encontrados, son un grupo de genes que codifican para enzimas catalasas y poliaminas que actúan como protectoras de las bacteria contra el ambiente oxidativo, lo que sugiere una preparación para las condiciones cambiantes dentro de la célula del huésped. También se observo la presencia de otros genes controlados por HrpG involucrados a la adhesión de la bacteria a la pared celular de la planta que son importantes en las primeras fases de infección.

Este trabajo tiene importancia al ser según los autores la primera investigación en patógenos de plantas de los genes blancos de los regulador hrp en la cascada de patogenisidad del sistema de secreción tipo tres (TTSS), y provee una visión del circuito de regulación que monitorea la expresión de múltiples factores de virulencia, sugiriendo una relación directa entre el TTSS y otros factores de virulencia.

Manuel Guillermo Moreno

Citation: Valls M, Genin S, Boucher C (2006) Integrated regulation of the Type III secretion system and other virulence determinants in Ralstonia solanacearum. PLoS Pathog. 2(8): e82. DOI: 10.1371/journal.ppat.0020082

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